辉大基因开发出新型RNA碱基编辑器ceRBE，紧凑高效展现体内治疗巨大潜力

基因编辑技术的发展使分子生物学领域发生了革命性的变化，并为治疗遗传疾病开辟了新的可能性。其中一种技术是RNA碱基编辑，它可以在不改变DNA序列的情况下对RNA序列进行精确修饰，避免了DNA编辑脱靶引起的基因组的永久性改变。其中，由催化失活的 CRISPR-Cas13（dCas13）蛋白和RNA脱氨酶（ADAR或突变体）组合的编辑器，在体外细胞的多个位点中都表现出很好的腺嘌呤到肌苷（A-to-I）或胞苷到尿苷（C-to-U）的编辑效率^1-3。然而，基于dCas13的RNA碱基编辑器尺寸较大，难以包装到单个腺相关病毒（AAVs）中进行有效的体内递送，限制了其在体内治疗中的应用。因此，需要一种在体内具有更高编辑效率的更小的RNA碱基编辑器。

2023年4月25日，辉大（上海）生物科技有限公司（简称，辉大基因）研发团队在《Advanced Science》期刊发表了题为“Develop a compact RNA base editor by fusing ADAR with engineered EcCas6e”的研究论文。该研究利用由199个氨基酸构成的EcCas6e蛋白取代了体积较大的dCas13蛋白，通过与ADAR脱氨酶融合，开发了一种紧凑高效的RNA碱基编辑器（ceRBE）。研究人员在HEK293T细胞中发现，跟已有的dCas13蛋白介导的RNA碱基编辑器（RESCUE-S²）相比，ceRBE在内源位点中实现了更高效的A-to-I和C-to-U的碱基编辑，并表现出更低的转录组水平脱靶。通过包装成AAV并递送到Duchenne肌营养不良（DMD）的人源化小鼠模型中，ceRBE编辑器成功修复了DMD Q1392X突变（编辑效率68.3±10.1%），并高效地恢复了基因产物蛋白的表达。该研究不仅开发了一种紧凑高效的RNA碱基编辑器，且对于RNA碱基编辑技术应用到疾病治疗领域中提供了更多的支持。

为了开发小体积的RNA碱基编辑器，研究人员选择了10种属于1类CRISPR-Cas系统并参与了crRNA前体加工过程的小体积的Cas蛋白。通过与ADAR脱氨酶融合表达，在HEK293T细胞中进行了效率探究。其中由199个氨基酸构成的EcCas6e蛋白介导的编辑器，表现出最好的编辑效率和最少的转录组水平脱靶。随后，研究人员从蛋白、crRNA结构、亚细胞定位和间隔区长度等方面，对EcCas6e蛋白介导的编辑器进行了改造，并最终得到了一种小体积、高活性且更安全的RNA碱基编辑器（ceRBE）。在HEK293T内源位点中，相比现有的dCas13介导的RNA碱基编辑器（RESCUE-S），含有相同脱氨酶的ceRBE编辑器表现出更高的编辑效率和更好的安全性。值得注意的是，ceRBE在之前报道的RESCUE-S无法编辑的SMN1、NF1、NF2和RAF1位点²也实现了非常高效的编辑（图一）。

图一. 紧凑高效的RNA碱基编辑器（ceRBE）的筛选、优化和验证

为了进一步探究ceRBE的在体治疗潜力，研究人员构建了人源化DMDQ1392X模型小鼠，并利用AAV将ceRBE碱基编辑器递送到了8周龄疾病小鼠的的右胫骨前肌（TA）中。注射后3周，采集TA组织并分析碱基编辑效率、免疫印迹和肌营养不良蛋白表达的免疫荧光。结果显示，A-to-I的编辑效率达到68.3±10.1%，肌营养不良蛋白的表达也基本恢复（免疫印迹：49.3±2.4%；组织学染色：68.1±9.4%）。RNA测序脱靶分析结果也证明了ceRBE的在体安全性。总之，系列结果证明了ceRBE在体内有效编辑RNA的潜力并为推进RNA碱基编辑技术在遗传疾病治疗中的应用提供了支持（图二）。

图二. ceRBE在人源化DMD^Q1392X模型小鼠中的治疗效果

辉大基因王兴博士、李国玲博士为本研究论文的共同第一作者，杨栋博士作为共同第一作者之一，目前已入职辉大基因。辉大基因樊占青作为参与者作出了重要贡献。辉大基因创新研究院院长周英思博士、辉大基因创始人&首席科学顾问杨辉研究员为该论文通讯作者。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202206813