重磅｜辉大团队开发出特异性更高，安全性更好的高保真Cas13蛋白变体，研究成果登《Nature Biotechnology》

最近发表在《Nature Biotechnology》上的一项研究揭示了高保真Cas13变体的发展，其通过诱变显著降低了副作用，并证明了hfCas13在哺乳动物细胞和动物中几乎没有副作用的情况下有效降解靶向RNA的可行性。这项工作由神经科学研究所杨辉博士实验室、中国科学院脑科学与智能技术卓越中心、神经科学国家重点实验室和有限公司研发团队的研究人员完成。

CRISPR-Cas13系统是可编程RNA靶向的高效工具，已被用于各种细胞类型和生物体的核酸检测和RNA操作。然而，人们对Cas13的脱靶效应表示担忧。先前的结构研究表明，当Cas13与靶RNA结合时，两个HEPN核酸酶结构域可以在蛋白质表面形成催化位点，除了靶RNA的靶上切割外，还可能对旁观者RNA进行混杂切割。由于这种所谓的副作用，Cas13可以随机降解靶RNA和非靶RNA，因此在使用Cas13时难以设计实验和解释结果。因此，Cas13系统的基础研究和未来的体内应用需要尝试通过工程方法减少或消除混杂的RNA降解。

研究人员设计了一种双荧光报告基因（EGFP&mCherry）质粒系统来检测哺乳动物细胞中Cas13的副作用。在该系统中，mCherry荧光细胞的缺失被解释为成功的靶向编辑；EGFP荧光细胞的缺失被认为代表脱靶切割。结果表明，Cas13a或Cas13d均可引起显著的副作用。然后，研究人员试图通过诱变和筛选副作用最小的变体来设计Cas13d（RfxCas13d或CasRx，Cas13d来自黄腐球菌XPD3002），基于一个新的精心设计的双荧光报告系统，该系统由含有EGFP、mCherry和EGFP靶向gRNA的单个质粒以及每个Cas13变体组成。

图1.工程高保真Cas13变体的设计、筛选和表征

杨辉的团队设计并生成了Cas13d变体的诱变文库，并将其单独转染到HEK293细胞中。通过使用流式细胞术分析报告基因荧光，五种变体（N1V7、N2V7、N2 V8、N3V7和N15V4）表现出相对较低百分比的EGFP+细胞，但mCherry+细胞的百分比较高，表明靶上活性较高，而副产物活性降低。变体N2V8因其对RNA降解的最高特异性而被称为高保真Cas13d（hfCas13d），用于进一步的表征，包括使用RNA测序的转录组宽脱靶分析。当靶向几种内源性转录物（如PPIA）时，hfCas13d显示出脱靶基因数量的显著减少。此外，hfCas13变体在细胞系、转基因动物和体细胞中没有显示出可检测的附带损伤，这支持了它们的体内应用。

图2.野生型Cas13d副作用的细胞和体内后果以及使用hfCas13d消除副作用。

重要的是，杨辉的团队在2021年鉴定了CRISPR-Cas13X系统，这是目前最小的（只有775个氨基酸）RNA编辑工具。在这项新的研究中，研究人员进一步改造了Cas13X，并获得了hfCas13X变体，该变体对靶向RNA降解具有高度特异性，但副作用最小。hfCas13X将在基于RNA编辑的基因治疗领域显示出巨大的应用潜力。

这项题为“高保真Cas13变体用于靶向RNA降解，副作用最小”的工作于2022年8月11日在线发表在《Nature Biotechnology》杂志上。汤华伟、黄佳、肖清泉、何冰冰、董雪、刘远华为共同第一作者，贡献相等。这项工作得到了科技部、国家自然科学基金、CAS和中科院的支持。

作者联系人：

杨辉

中国科学院脑科学与智能技术卓越中心（神经科学研究所），中国上海。

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